COURS DE CHROMATOGRAPHIE  (Master de Chimie 1ère année)  Faculté des Sciences d'Orsay

OPTIMISATION D'UNE SÉPARATION CHROMATOGRAPHIQUE

6-1 – LE TRIANGLE DES COMPROMIS

Figure 6-1 : Triangle des compromis

Trois critères contradictoires sont exigés pour mener à bien une analyse chromatographique : la résolution, le temps d'analyse (critère de rapidité) et la quantité à injecter
(critère de sensibilité). Si on porte l'accent sur un critère (un sommet du triangle), les 2 autres sont automatiquement défavorisés, ainsi :
- Si on privilégie la sensibilité, il faut souvent injecter une grande quantité de produit, la colonne se sature, la résolution chute et le temps d'analyse augmente
- Si le temps d'analyse est privilégié, on utilise des colonnes courtes et la résolution chute.
- Si on favorise la résolution, on utilise une colonne plus longue et de plus faible diamètre intérieur, on peut injecter moins de produit ce qui fait diminuer la sensibilité et
augmenter le temps d'analyse.
Les trois paramètres sont donc à optimiser. Le centre du triangle des compromis (figure 6-1) correspond à une situation moyenne.

Définition des paramètres à optimiser
La résolution : Il est important dans une analyse chromatographique d'obtenir une bonne séparation des produits. C'est à dire des pics  étroits et  séparés,
caractéristiques d'une bonne résolution.


Figure 6-2 : Séparation de deux pics en chromatographie
 La résolution est donnée par la formule de Purnell (équ.3-8), où
= t'rB/t'rA  et k' =k'B

Purnell(equ. 3-8)

Le temps d'analyse:  Le temps d'analyse correspond à l'élution du dernier pic du chromatogramme, il est donc assimilé à ce temps de rétention : ta = tr
Le temps de rétention (tr) dépend du facteur de rétention (k') et du temps mort (tm)    :   
    tr = (1+k')*tm 
Comme tm *u = L où u est la vitesse de la phase mobile et L la longueur de la colonne. on a : (eq. 6-1)
comme L= NH,   tr devient     avec la formule de Purnell tr se présente comme suit : (eq.6-2)

l'expression (6-2) est  approchée, car H est fonction de u, mais si u>>uopt l'équation de Van Deemter montre que (H/u) est à peu près constant.

Les expressions (3-8) et (6-2) dépendent donc du même jeu de 3 paramètres a, k' et N. Pour conduire l'optimisation on fera varier chaque paramètre
indépendamment des 2 autres pour déterminer leur influence respective sur ta et sur R.

6-2 OPTIMISATION DES QUANTITES A INJECTER

La quantité de soluté qui peut être injectée dans une colonne varie avec les différents types de chromatographie. On peut définir deux termes Q0 et Qs:

Q0  est la quantité minimum détectable (pour avoir un rapport signal sur bruit S/N=4). Ce paramètre dépend essentiellement de la sensibilité du détecteur du chromatographe.

Qs (s pour saturation) est la quantité maximum injectable  pour avoir un élargissement des pics <10%, ce paramètre est critique et est fonction des caractéristiques de la colonne
En CPG Qs est proportionnel à la longueur (L) et au rayon de la colonne (r) ainsi qu'à l'épaisseur du film de phase stationnaire (e). En CPG, on pourra injecter
une "grande quantité" de produits en évitant la saturation  sur les colonnes "wide bore"  (r et e importants), à l'inverse les colonnes
"Fast GC" (où L, r et e sont petits) atteindront facilement leur seuil de saturation.
Exercice d'application 6-1. (Optimisation de la quantité injectable)
On peut injecter au maximum 10 ng de soluté sur une colonne capillaire (1) de 25 m de long de 0,25  mm de diamètre intérieur avec une épaisseur
de 0,25 mm de phase stationnaire.
1- Quelle quantité de produit pourra t'on injecter au maximum sur une colonne (2) "wide bore" de 25 m de long de 0,53 mm de diamètre intérieur
avec une épaisseur de 5 mm de phase stationnaire ?
2- Quelle quantité de produit pourra t'on injecter au maximum sur une colonne (3) "Fast GC" de 10m de long de 0,1 mm de diamètre intérieur
 avec une épaisseur de 0,1 mm de phase stationnaire ?
Solutions
1-  Qs(2) = Qs(1) x (0,53/0,25)x(5/0,25) = Qs(1) x 42,4 = 424 ng .
2- Qs(3) = Qs(1) x(10/25)x (0,1/0,25)x(0,1/0,25) = Qs(1) x 0,064 = 0,64 ng

6-3-OPTIMISATION PAR LE FACTEUR DE SÉPARATION (a)

  6-3-1.Influence sur la résolution

Si on augmente le facteur de séparation (la sélectivité) a, c'est à dire la différence d'énergie libre de dissolution drG) entre les deux produits, la résolution augmente d'après l’équ.3-8).

 a=(tr(B)-tm)/(tr(A)-tm) est toujours supérieur à 1.

En théorie, comme le montre la courbe ci-dessous, de faibles variations de a au voisinage de 1 peuvent entraîner de grandes variation de la résolution.


Figure 6-3 Variation de la résolution en fonction de a.

Figure 6-4 Influence de a sur la Résolution de 2 pics (k' et N sont invariants)

La résolution double (entre 0,1 et 0,2) si a varie entre 1,11 et 1,25., donc augmente de 14% seulement.

En pratique, il faut toujours prendre le bon couple (phase mobile/phase stationnaire) pour que le paramètre a soit > 1,5  et permette ainsi une séparation facile.

Exercice d'application  6-2.
Pour des valeurs constantes de N= 1600 et k' =3,  et des valeurs variables de a(=1,25; 1,2; 1,1 et 1,05) calculer les résolutions R obtenues.

Solution.

a 1,25
 1,20
 1,10
 1,05
R 1,5
 1,25
 0,68
 0,36

  6-3-2.Influence sur le temps d'analyse

Le temps d'analyse est extrêmement sensible au paramètre a  si il est inférieur à 1,5, il augmente énormément si a diminue.

Les diminutions du facteur de séparation se payent donc cher en temps d'analyse lorsque a est trop petit.

En revanche lorsque a  est supérieur à 2 le temps d''analyse est relativement insensible à ce terme.
Figure 6-5 Variation du temps d'analyse en fonction de .
Exercice d'application  6-3
Calculer l'influence de a sur tr,
1- lorsque a passe de 1,5 à 1,1.
2- lorsque a passe de 1,05 à 1,01.
Solution.
1-D'après  6-2.  a passant de 1,5 à 1,1 le temps d'analyse est multiplié par 13,4.
2- Si a passe de 1,05 à 1,01 le temps d'analyse est multiplié par 23.

Pratiquement.  Lorsque a est proche de l'unité, cela signifie que la différence d'énergie libre de dissolution entre les 2 produits est trop faible, il faut donc augmenter a. On peut:

1- soit changer la composition de la phase mobile en HPLC (impossible en CPG)
2- soit prendre une phase stationnaire différente, ce qui revient à alors changer de colonne.
3- en CPG, diminuer la température, car   lna = -(G°(B) - G°(A))/ RT

6-4-OPTIMISATION PAR LE FACTEUR DE RÉTENTION (k')

  6-4-1.Influence sur la résolution
k' est proportionnel à la constante d'équilibre K. (k' =K/b).


Figure 6-6 Variation de la résolution en fonction de k'.

Figure 6-7 Influence de k' sur la Résolution de 2 pics ( et N sont invariants)

 La Figure 6-6 montre que la résolution croit avec le terme k'.Comme le terme k'/(1+k') plafonne vers 1, les gains de résolution deviennent négligeables lorsque k' devient supérieur à 5. 
Une valeur de k' comprise entre 5 et 10 entraîne donc une résolution (presque) maximum.

6-4-2- Influence sur le temps d'analyse

D'après l’équ.6-2, le terme y=(1+k')3/k'2  est minimum pour k'=2 puis il croit lentement lorsque k' augmente (Cf. figure 6-8).


Figure 6-8 Variation du temps d'analyse en fonction de k'.

En revanche, l'asymétrie de la courbe ci-contre montre que des valeurs de k' inférieures à 1,5 sont plus préjudiciables à la rapidité de l'analyse que des valeurs de k' supérieures à 2.
Dans le cas de mélange complexe, en HPLC, où les produits les plus retenus ont des valeurs de k' trop élevées, on a intérêt à changer la composition de la phase mobile
en cours d'élution de telle sorte que pour chaque soluté la valeur de k' soit optimale.En revanche, si k' augmente trop le temps d'analyse devient important d'après la formule 6-2.
En CPG, k' est souvent >20, son influence sur la résolution est donc minime.
En revanche en HPLC où k' est plus petit, on peut jouer sur ce terme pour le placer dans l'intervalle  2-10. k' = 5 étant la valeur "idéale" 

Pratiquement, faire varier le facteur de rétention k' revient à:
1- En HPLC changer la phase mobile de manière à faire varier le coefficient de partition K des produits à séparer (car  k' =K/b )
On peut ainsi changer le solvant pour que k' soit dans l'intervalle optimum 1-5. (utilisation des gradients de solvant)
2- En CPG et HPLC, changer la phase stationnaire de manière à faire varier le coefficient de partition K des produits à séparer. (car  k' =K/b )
3- En CPG et HPLC faire varier la quantité de phase stationnaire (en CPG augmenter l'épaisseur du film e dans une colonne capillaire)
4- En CPG , faire varier le diamètre intérieur (d) de la colonne (car k' =K/b = 4Ke/d).
5- en CPG, faire varier la température (car   ln(k') = -H/RT +C)

Exercice d'application  6-4.
Calculer l'influence de k' sur R et tr, lorsque k' passe de 2 à 5 puis de 5 à 10.

Solution.

k'
 passe de 2 à 5
 passe de 5 à 10
R1/R2 1,25
 1,36
tr1/tr2 1,28
 1,97

Si k' passe de 2 à 5, la résolution est multipliée par un facteur 1,25, le temps d'analyse (tr) augmente dans les mêmes proportions, car il est multiplié par 1,28.
Si k' passe de 5 à 10, le temps d'analyse (tr) double alors que la résolution n'est améliorée que de 40 %.

Ceci est un bon exemple des compromis auxquels on est confronté en chromatographie.


6-5-OPTIMISATION PAR LE NOMBRE DE PLATEAUX THÉORIQUES (N)

  6-5-1.Influence sur la résolution          
La résolution croît seulement comme la racine carrée de l'efficacité (N) comme le montre la figure 6-9; Ainsi augmenter l'efficacité d'une colonne,
pour améliorer la séparation de deux produits, ne donne pas toujours les résultats favorables attendus. Par exemple en CPG, si on double la longueur d'une colonne,
on multiplie le nombre de plateaux théoriques donc son efficacité par deux, mais la résolution ne sera améliorée que par un facteur (2)½=1,414 

Figure 6-9  Influence de N sur la résolution
Figure 6-10  Simulation de l'influence de N à et k'constants

    6-3.2.Influence sur le temps d'analyse

D'après (equ.6-1), le temps d'analyse est proportionnel à N et à la longueur L de la colonne, il est multiplié par 2 si on double la longueur de la colonne.

Exercice d'application  6-5.

Pour améliorer une séparation, on décide de doubler la longueur de la colonne. Quel sera le résultat de cette décision  sur R et tr ?

Solutions.
La résolution R sera augmentée d’un facteur  (2)½= 1,414 ; comme tr est proportionnel à la longueur, le temps d'analyse doublera.

Pratiquement, on peut augmenter l'efficacité d'une colonne, c'est à dire le nombre de plateaux théoriques N en effectuant les manipulations suivantes :
1- En HPLC diminuer la granulométrie du support de la phase stationnaire.           
2- En CPG et HPLC, augmenter la longueur (L) de la colonne

6-6-OPTIMISATION PAR LA VITESSE DE LA PHASE MOBILE (u)

  6-6-1.Influence sur la résolution          
La courbe de Van Deemter donne la dépendance de H avec u.
Cette courbe montre que l'on pas intérêt à trop diminuer le débit de phase mobile au-dessous de la valeur optimale uopt, car H augmente rapidement
et la résolution R se détériore très vite (via N) pour des valeurs faibles de u. En revanche, on a parfois intérêt à se placer à une vitesse de phase mobile supérieure
à la valeur optimale (u >uopt). où si la pente de la courbe est plus faible des variations de u conduiront à des valeurs acceptables de H, N et donc R.

figure 6-11 Courbe de Van Deemter

Étant donné l'équation de la courbe de Van Deemter : H = A +B/u + Cu     (équ.2-8)

La dérivé est égale à  dH/du = -B/u2 + C cette dérivée est nulle pour uopt d'où

uopt = √(B/C) et Hopt = A + 2√BC et Nopt = L/Hopt

Cas particulier des colonnes capillaires : A= 0 d'où uopt = √(B/C)

et Hopt =  2√BC donc Nopt =L/2 (√BC)

En HPLC, on peut augmenter beaucoup plus qu'en CPG la vitesse de la phase mobile (u >uopt) sans trop de dommage pour la résolution.

6-6-2 - Influence de la vitesse de la phase mobile sur le temps d'analyse

La formule (6-1) montre comment la vitesse de la phase mobile influe sur le temps d'analyse :
Si (u >uopt) H augmente relativement peu avec u (presque pas en HPLC) mais par contre le temps d'analyse ta= tr décroît ce qui peut être très intéressant.

Exercice d'application 6-6

En CPG à 60°C , on veut séparer deux isomères sur une colonne remplie de phase stationnaire OV17 de 2m de longueur.
L'analyse est conduite avec la vitesse optimale d'hélium à 20 cm/sec. On obtient les facteurs de rétention k' suivants:

k'(2-méthylpentane) = 4  et k'(n-hexane) =4,4

1- Calculer le nombre de plateaux théoriques de la colonne sachant que l'on observe une résolution de 1,5 entre les deux pics.
2- Calculer le temps d'analyse
3- La courbe de Van Deemter montre que au dessus de la vitesse optimale de la phase mobile  (u >uopt) , on a la relation suivante H= 2/3*(Hopt/uopt)*u
Que deviennent la résolution et le temps d'analyse, si on augmente la vitesse du gaz vecteur à 60 cm/sec ?
4- Quelle est la longueur de la même colonne OV17, qui serait nécessaire pour maintenir la même résolution de 1,5 entre les 2 pics ?
Quel serait dans ce cas le temps d'analyse?

Solution.
1- Le facteur de séparation est  : a= 4,4/4 =1,1 d'où
2-tm = L/u = 200/20=10 sec et le temps d'analyse tr =(1+k')tm = 54 sec.
3- Calcul de Hopt : Hopt = L/N= 0,30 mm à uopt = 20 cm/sec
Calcul de H à u = 60 cm/sec, H = 2/3*(0,3/20)*60 = 0,60 mm.
N = Hopt = 2000/0,06 = 3280 plateaux théoriques  (N = Nopt/2) . D'où la résolution entre les 2 pics :
tm = L/u = 200/60=3,33 sec et le temps d'analyse tr =(1+k')tm = 18 sec.
L'analyse a été effectuée en trois fois moins de temps, par contre la résolution a bien chutée.
4- Si la résolution est inchangée, cela signifie que le nombre de plateaux théoriques est lui même inchangé, donc N=6560.
La longueur de la colonne devient : L=NH=6560*0,6=3936mm = 4 m
tm = L/u = 394/60=6,56 sec et le temps d'analyse tr =(1+k')tm = 36 sec.
En conclusion, pour maintenir la résolution à haut débit d'hélium, il faut doubler la longueur de la colonne (mettre 2 colonnes bout à bout !),
dans ce cas le temps d'analyse est raccourci de 35%.

Pratiquement, on peut augmenter l'efficacité d'une colonne, en jouant sur le débit de la phase mobile en effectuant les manipulations suivantes:
1- En CPG et HPLC, changer la vitesse de la phase mobile (u) pour atteindre uoptimal, sur la courbe de Van Deemter,
2- En HPLC, Il faut toujours avoir une vitesse de phase mobile supérieure ou égale à uoptimal.

6-7- CONCLUSIONS SUR L'OPTIMISATION

Nous avons vu que les critères résolution, temps d'analyse et sensibilité sont interdépendants, toute modification de l'un d'entre eux a des répercussions sur les deux autres.
 
Paramètres expérimentaux
 Résolution (R) x par :
 Temps d'analyse (ta) x par
 Quantité maximum injectable (Qs) x par :
Colonne
Rayon intérieur (r) x2
Longueur (L) x2
¼
1, 414
1
2
(>2)
2
Phase stationnaire
épaisseur du film de phase stationnaire (e) x2
x(<1)
2
2
Phase mobile (gaz vecteur)
Débit optimal N2
Débit optimal N2 x3
Débit optimal He
Débit optimal He x3
Débit optimal H2
Débit optimal H2 x3
1
½
1
½
1
½
12
4
4,5
1,5
3
1
 Inchangée
Température
Température T
T+ 30°C
T+60°C
de T à T+60°C (programmation de température)
2,8
1,4
1,1
2,6
4
2
1
2
 Inchangée
Ce tableau est valable principalement pour la CPG. Comment des modifications expérimentales en CPG sur une colonne capillaire se répercutent sur les 3 critères
à optimiser étudiés dans ce chapitre (la résolution, le temps d'analyse (critère de rapidité) et la quantité à injecter (critère de sensibilité))

 

6-8- PROBLÈMES SUR L'OPTIMISATION

Exercice 6-7 (examen septembre 2000)


Figure 6-11
Figure 6-12

Figure 6-13
Figure 6-14
1/ Pour la figure 6-11, la vitesse de l'hélium est de 60 cm/sec. Calculez les temps morts des 3 colonnes sachant qu'elles ont un même diamètre intérieur
et qu'elles utilisent toute la même épaisseur de la même phase stationnaire, seules les longueurs des colonnes ont changé.
2/ Pour la figure 6-11, calculer théoriquement les termes R2/R1, R3/R2, comparer avec les termes expérimentaux.
3/ Pour la figure 6-11, calculer théoriquement les rapports des temps d'analyse ta2/ta1, ta3/ta2 , comparer avec les valeurs expérimentales.
En déduire le facteur de rétention moyen du produit le plus retenu sur ces 3 colonnes.
4/ Justifier théoriquement les changements observés dans la figure 6-12 sur ta et R. Dans ce cas seules les épaisseurs du film de phase stationnaire ont varié
les autres paramètres expérimentaux sont restés invariants.
5/ Justifier théoriquement les changements observés dans la figure 6-13 sur ta et R Dans ce cas seuls les diamètres intérieurs des colonnes ont varié,
les autres paramètres expérimentaux sont restés invariants.
6/Justifier théoriquement les changements observés sur les temps de rétention dans la figure 6-14. Dans ce cas seule la phase stationnaire dans la colonne
a changé les autres paramètres expérimentaux sont restés invariants.

Solutions
1-
L(m)
 15
 30
 60
Tm (mn)
 0,42
 0,83
 1,66

2 et 3-


 Théorique
 Expérimental
R2/R1 1,414
 1,419
R3/R2 1,414
 1,426
ta2/ta1 2
 2.02
ta3/ta2 2
 2,04


Colonne
 15 m
 30 m
 60 m
tr
 3,7
 7.5
 15,3
k'
 7,8
 8,03
 8,18
 
k' moyen = 8.00 4- k' = K/b et b = d/4e d'où k' = 4Ke/d .
K est invariant, puisque les phases stationnaire et mobile sont les mêmes. Comme K, L, d et tm ne changent pas, k' est proportionnel à e et comme R croit avec k' (Purnell) ,
si e augmente, k' augmente et donc R augmente.
5- Formule idem 4, si d diminue k' augmente et donc R augmente. 
6- Formule idem 4. Pour les produits polaires K augmente et donc k' et  le temps d'analyse ta .

Exercice d'application 6-8.

Une séparation 5 sucres a été obtenue en HPLC analytique  dans les conditions suivantes :

Conditions
Colonne: SUPELCOSIL LC-NH2, 25cm x 4.6mm ID, particules de 5µm
Phase mobile: acétonitrile/éthanol/eau (75/8/17) (v/v/v)
Débit: 2mL/min.    Temp: 30°C.  Det.: réfractomètre
Échantillon: 20µL


Les temps de rétention suivants ont été mesurés :

n°

1

2

3

4

5

tr (min)

3,43

3,80

4,15

7,02

9,27

 Le temps mort est 1,20 mn.

Cette séparation est-elle possible sur une colonne HPLC préparative de 2500 plateaux théoriques et en maintenant une résolution égale à 1 ?

Les 2 colonnes ont des phases stationnaires et mobiles identiques, une étude préliminaire a montré que les facteurs de rétention sont approximativement les mêmes pour les deux colonnes

Solution

n° du pic
 1
 2
 3
 4
 5
tr (min)
 3,43
 3,8
 4,15
 7,02
 9,27
k'
 1.86
 2,167
 2,46
 4,85
 6,725

Doublet de pics
 1/2
 2/3
 3/4
 4/5
facteur de séparation (a)
 1,165
 1,134
 1,97
 1,39
Les pics 2 et 3 sont donc les plus difficiles à séparer, car a(2,3) = 1,134.
Avec R= 1,  N = 16*[(1,134/0,134)*(3,46/2,46)]2 = 2267 P.T., la séparation est donc possible en HPLC préparative où N= 2500 P.T.

Exercice d'application 6-9

La patuline est une substance cancérigène qui se développe sur les pommes pourries, sa détection et son dosage sont obligatoires pour tous les produits finis à base pomme (jus, cidre…).

Le chromatogramme ci-contre démontre la présence de patuline dans du cidre. Il a été obtenu sur une colonne analytique A où NA = 6000 pt. La résolution minimum entre la patuline et son impureté la plus proche est de RA=3.

On décide d’isoler la patuline sur une colonne préparative P avec NP = 1100 pt.

Ces 2 colonnes ont des phases stationnaires et mobiles identiques. De plus des tests préliminaires ont montré que les produits ont les mêmes facteurs de rétention sur les 2 colonnes.

Pour obtenir une séparation correcte, la résolution sur la colonne préparative doit être au moins égale à RP = 1,25.

Pourra t’on isoler la patuline à l’aide la colonne P ?

Solution:
Comme les termes k' sont identiques, les paramètres a seront aussi les mêmes. La formule de Purnell donne (RA/RP)2= NA/NP  Calculons NP qui permette une résolution de 1,25.
NP = NA*(RP/RA)2 = 6000*(1,25/3)2 = 1041 pt.    L’isolation de la patuline sera possible.