THÉORIE DE LA CHROMATOGRAPHIE (1)

1-1 – COMMENT AMÉLIORER UNE SÉPARATION EN CHROMATOGRAPHIE ?

Figure 1-1: Séparations entre 2 pics en chromatographie

Il y a deux possibilités pour améliorer la séparation entre les 2 pics du chromatogramme (a) :

1- A largeur de pic constante, on peut augmenter la différence de temps de rétention entre les 2 pics, ceci est illustré dans chromatogramme (b)

 2- A temps de rétention constant, on peut diminuer la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre ce phénomène.

En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2 paramètres pour améliorer une séparation.

En conclusion, deux paramètres s'avèrent donc primordiaux en chromatographie, la rétention et la forme du pic.

1-2- PARAMÈTRES CARACTÉRISANT LA RÉTENTION.

Le chromatogramme du Prozac (antidépresseur) a été enregistré dans les conditions suivantes : HPLC.  Colonne C18: 15cm x 4.6mm Phase mobile: acetonitrile / 25mM KH2PO4   pH 7.0 (40:60) Débit: 2mL/min.  Température: 30°C Détecteur UV : 254 nm .   Injection: 1µL

Figure 1-2: Chromatogramme du Prozac

1-2-1- Le temps de rétention.

Le temps de rétention tr d'un produit S est le temps écoulé entre le début de l'injection et la sortie du produit. (pour le chromatogramme 2, tr = 3mn)

tr dépend du produit S et des conditions expérimentales (colonne, température, débit de phase mobile... etc.)

1-2-2- Le volume de rétention

Le volume de rétention Vr correspond au volume de phase mobile nécessaire pour éluer le produit S. Si D est le débit de la phase mobile (D supposé constant) :

1-2-3- Le   temps mort.

Le  temps mort tm est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne. (dans la figure 2, tm = 1mn)

         u  = L / tm  (pour le chromatogramme 2, u  = 15 cm/mn)

1-2-4- Le  volume  mort.

On appelle volume mort Vm le volume de phase mobile qui passe à travers la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de la colonne (pendant le temps tm). Autrement dit, Vm est le volume occupé par la phase mobile dans une colonne.

           Vm  = tm * D.      (pour le chromatogramme 2,Vm = 1*2 = 2 ml)

Vm ne dépend que de la géométrie et du remplissage de la colonne.

1-2-5- Volume et temps de rétention réduits

On appelle volume de rétention réduit V'r, la différence entre les termes Vr et Vm.

            V'r = Vr - Vm           (eq.1-1)              (pour le chromatogramme 2, V'r =  4 ml)

Le volume de rétention réduit correspondant au  produit S  est le volume de phase mobile qui doit passer à travers la colonne pour éluer le composé S.

De la même façon, on définit un temps de rétention réduit t'r.

            t'r = tr - tm                 (eq.1-2)           (pour le chromatogramme 2, t'r =  2 mn)        

Les volumes et temps de rétention réduits sont indépendantes des volumes et temps morts, elles dépendent donc moins de l'instrumentation (de la colonne).

1-2-6- Le facteur de rétention (ou de capacité).

  ou également            (eq.1-3)

Ce qui donne : Vr  = Vm(1 + k’)    et  tr  = tm(1 + k’)    ((eq.1-4)      

Les facteurs de rétention sont des grandeurs sans dimension donc plus générales d'un produit donné que les temps ou les volumes de rétention réduits. (pour le chromatogramme 2, k' =  2)

D'où une définition du facteur de rétention d'après (eq.1-3) : c'est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobile.

1-3- INTERPRÉTATION THERMODYNAMIQUE DES PARAMÈTRES DE RÉTENTION

1-3-1- La constante d'équilibre (ou constante de partition) K

Le problème est le suivant: trouver les relations entre les paramètres de rétention (Vr, k', tr' et tr) et la constante d'équilibre K caractérisant l'équilibre suivant:

L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisé par la constante d'équilibre K, appelée aussi constante de partition.

            ms = masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire

            Vm = volume de la phase mobile (équivalent au volume mort)

            Vs = volume de la phase stationnaire

Vm et Vs sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée ( b= Vm/Vs).

Le paramètre b, appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une colonne de chromatographie.

b sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en phase gazeuse.

La relation (eq.1-5) devient :               (eq.1-6) 

1-3-2- Le facteur de rétention k'

D'après (eq.1-3), on déduit que        

Si on suppose que Vr est proportionnel à la masse totale de soluté dissous dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.

On a donc Vr proportionnel à ( ms + mm )

De la même façon, si on suppose que Vm est proportionnel à la masse de soluté dissous dans la phase mobile.

On en déduit que    et d'après eq.1-6 on a donc
ce qui nous donne une relation fondamentale de la chromatographie :   

La dernière expression est cohérente, si un produit n'a aucune affinité avec la phase stationnaire : [Ss] = 0 donc K = 0 et tr = tm . Ceci est le cas de  l'air ou en première approximation du CH₄ en CPG, ce qui permet la mesure du temps mort.

1-3-4-  Influence de la température sur les temps de rétention réduits tr'

K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1-9), où G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc G° est négative. (eq.1-9)

  (eq.1-10)

Où G° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté entre les phases mobile et stationnaire.

Plus G°(dissol pm→ ps) est petit (grand en valeur absolue), plus la constante d'équilibre K est grande, plus le produit est retenu sur la colonne, plus le tr est grand.

D’après la figure 1-3, il apparaît que pour avoir une séparation chromatographique, il faut que :

G°(dissol pm→ ps) <0 soit G°(dissol  ps) <G°(dissol pm)  ou en valeur absolue  ‌G°(dissol ps) > ‌G°(dissol pm)‌

G°(dissol pm→ ps) est fonction de la température, en effet G° = H° - T*S° .

Si l'on suppose que H° et  S°  sont indépendants de la température, la formule (eq.1-10) devient

ln tr' = -H°/RT + S°/R - ln b+ ln tm         

Soit (eq.1-11)

où A et B sont des  constantes pour un produit donné et une colonne donnée.

 
Considérons deux températures T1 et T2 où T2>T1 avec les facteurs de rétention correspondants k'1 et k'2, la formule (eq.2-12) devient :

(eq. 1-12)

comme t'r1>t'r2, on voit que H° est toujours <0.

Le temps mort tm, peut être supposé indépendant de la température pour une colonne donnée et une pression donnée.
En réalité, lorsque la température augmente, le mouvement brownien augmente, la viscosité de la phase mobile (gaz) augmente et sa vitesse diminue légèrement dans la direction de la colonne. On observe expérimentalement une faible augmentation du temps mort avec la température.

1-4- EXERCICES D'APPLICATION

Exercice 1-4-1
Les paramètres thermodynamiques des produits suivants ont été mesurés sur une colonne capillaire ayant pour phase stationnaire un polysiloxane.
Les termes H° et S° correspondent aux variations d'enthalpie et d'entropie de dissolution des produits entre  la phase gazeuse et la phase stationnaire.
Quelle sera l'ordre d'élution de ces produits à 120°C ? Justifier votre réponse par un calcul simple.

	Décane	Butyl acétate	1-Heptanol	1-Bromobutane	Hexyl acétate
H° Kj/mol	-47,2	-34	-36.9	-31	-42
S° en u.e.	-75.4	-58	-58	-51	-66

On a G° = H° -TS°  , plus G° est petit (grand en valeur absolue) plus le produit est retenu sur la colonne. A 120°C soit T = 393°K , on a les résultats ci-dessous :

G° Kj/mol

-.17,5

-11,2

-14.1

-10.96

-16,06

Le chromatogramme de la nicotine a été obtenu dans les conditions suivantes : CPG. Colonne remplie Phase stationnaire: 10% Carbowax 20M/2% KOH sur 80/100 Chromosorb W AW Dimensions de la colonne: Longueur 6' (183cm) x 2mm (diamètre intérieur) Débit de la phase mobile: 20mL/min.  Quantité injectée:1µL Four: 200°C. Temps de rétention de la nicotine = 3,20 mn Four: 180°C. Temps de rétention de la nicotine = 6,60 mn Questions : 1- Calculer la vitesse linéaire (en cm/sec) de la phase mobile dans la colonne. 2- En déduire le temps mort de cette analyse. 3-Calculer le temps de rétention de la nicotine à 160°C. 4- Peut-on éluer la nicotine en 1 mn, sachant que la température limite d’utilisation de la colonne et de 250°C ?

1- le débit D = V/t = pr2L/t or la vitesse u = L/t d’où u = D/pr2

Application numérique :  u = 20//p(0,1)2 soit 636 cm/min ou 10,6 cm/sec

2- tm = L/u soit tm = 183/10,6 = 17,26 sec = 0,29 mn.

3- Pour la nicotine t’r= 2,91 mn à 200°C et t’r= 6,31 mn à 180°C

l'expression (eq.1-11) conduit à 2 équations avec 2 inconnues.

ln(2,91) = A/473 + B et ln(6,31) = A/453 + B

La résolution donne A=8408 et B= -16,7, d'où tr = 15,44 mn à T = 433°K soit 160°C

4-  A 250°C soit T = 523°K on obtient  t'r = 0,53 mn soit tr = 0,82 mn.

On peut donc éluer la nicotine en 1 mn en étant à une température inférieure à la température limite d'utilisation de la colonne (250°C)